Polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction atau sering disingkat sebagai PCR adalah suatu teknik perbanyakan materi genetik baik DNA yang terdapat pada kebanyakan mikroorganisme penyebab penyakit maupun RNA yang terdapat pada virus tertentu seperti virus imunodefisiensi manusia (HIV, penyebab AIDS) dan virus hepatitis C (HCV, penyebab hepatitis C). Karena kemampuan PCR untuk memperbanyak jumlah materi genetik sangat tinggi, maka PCR dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan materi genetik dengan jumlah sangat rendah dalam suatu spesimen atau sampel. PCR terdiri atas beberapa siklus dimana pada setiap siklus terjadi penggandaan materi genetik dan jika siklus ini dilakukan berulang-ulang, maka materi genetik yang diperoleh akan menjadi banyak sehingga mempermudah deteksi keberadaannya. Secara umum, PCR dilakukan sebanyak 25 – 35 siklus.

Kegunaan PCR
PCR banyak digunakan untuk berbagai tujuan, misalnya mendiagnosis penyakit keturunan (penyakit genetik), mendeteksi keberadaan penyebab penyakit infeksi seperti bakteri dan virus, mempelajari evolusi manusia, forensik dan lain sebagainya.

Peran PCR dalam laboratorium klinik
PCR dapat digunakan untuk menentukan secara kualitatif keberadaan suatu penyebab penyakit (patogen) dalam suatu spesimen dari individu yang diduga terinfeksi oleh suatu patogen. Selain itu, PCR juga dapat digunakan untuk menentukan kandungan materi genetik baik DNA maupun RNA dalam suatu spesimen. Penentuan kandungan materi genetik dapat dilakukan dengan PCR kuantitatif dan sangat penting untuk pemantauan terapi obat penyakit hepatitis B, hepatitis C dan AIDS.

Bagaimana PCR dilakukan?
PCR dilakukan menggunakan beberapa tahap. Pertama-tama, materi genetik harus diisolasi dari spesimen biologi, kemudian materi genetik diperbanyak secara spesifik menggunakan reaksi enzimatik dan tahap terakhir adalah tahap deteksi untuk mengetahui keberadaan dan kebenaran produk PCR. Tahap deteksi dapat dilakukan dengan beberapa cara salah satunya yaitu dengan hibridisasi.
Hibridisasi adalah suatu metode dimana produk PCR akan dikenali secara spesifik dengan suatu reagen, berupa materi genetik. Reagen ini disebut pelacak. Pelacak dapat ditandai dengan penanda warna atau fluoresense.

PCR konvensional
PCR konvensional adalah PCR dimana tahap perbanyakan materi genetik dan tahap deteksi produk PCR dilakukan secara berturut-turut, yaitu tahap deteksi dilakukan bila tahap perbanyakan materi genetik telah selesai. Tahap deteksi dapat dilakukan dengan beberapa cara (format), salah satunya menggunakan elektroforesis gel kemudian dilanjutkan dengan hibridisasi pada membran menggunakan reagen pelacak atau hibridisasi dalam tabung reaksi. Jika yang diekstraksi adalah materi genetik berupa DNA maka DNA dapat langsung diperbanyak, tetapi jika yang diisolasi berupa RNA, maka diperlukan tahap tambahan untuk mengubah RNA menjadi DNA yaitu tahap transkripsi balik. Dalam hal ini, metode yang digunakan disebut RT-PCR (reverse-transcription PCR). Tahapan dalam PCR dan RT-PCR konvensional dengan format deteksinya dapat dilihat pada gambar di atas.

Keterbatasan PCR konvensional
Pada PCR konvensional, deteksi produk PCR dilakukan hanya pada tahap akhir. Seperti terlihat pada gambar di samping ini, deteksi tahap akhir menunjukkan hasil yang bervariasi sehingga dapat memberikan pembacaan yang kurang akurat. PCR hibridisasi merupakan salah satu contoh PCR konvensional dengan produk komersialnya yaitu Cobas Amplicor. Pada Cobas Amplicor, deteksi dilakukan secara kolorimetri setelah perbanyakan materi genetik selesai. Keterbatasan lain untuk PCR hibridisasi adalah batas deteksi atau batas kuantitasi kandungan DNA atau RNA dalam sampel tidak cukup rendah dan rentang linearitas yang tidak cukup luas.

Real-time PCR
Berbeda dengan PCR konvensioal, pada real-time PCR tahap deteksi dan tahap penggandaan materi genetik dilakukan secara bersamaan (simultan). Hal ini menawarkan beberapa keunggulan yaitu: deteksi produk PCR dilakukan pada fase eksponensial sehingga hasil yang diperoleh berada pada rentang daerah dengan presisi hasil tinggi. Selain itu, deteksi dilakukan menggunakan pelacak bertanda fluoresense. Pelacak adalah reagen yang menentukan kespesifikan hasil. Penggunaan fluoresense dalam tahap deteksi menawarkan sensitivitas yang tinggi. Dengan demikian, real time PCR menawarkan sensitivitas yang tinggi dan rentang linearitas yang cukup luas sehingga hasil penentuan kandungan DNA atau RNA di dalam spesimen menjadi sangat akurat. Contoh produk komersial yang menggunakan real time PCR yaitu Cobas Taqman.

Real-time PCR dalam diagnosa klinik
Real-time PCR atau RT-PCR (jika materi genetik berupa RNA) dapat digunakan untuk penentuan kandungan DNA virus (misalnya virus hepatitis B) dan RNA virus (misalnya virus hepatitis C). Penentuan kandungan DNA atau RNA virus sangat dibutuhkan untuk pemantauan dan penentuan waktu yang tepat memulai pengobatan. Pemantauan pengobatan diperlukan untuk mengetahui apakah obat telah bekerja dengan baik atau tidak.