Gen Editing

Terapi gen secara historis telah didefinisikan sebagai penambahan gen baru untuk sel manusia. Namun, munculnya teknologi gen editing telah menimbulkan paradigma baru di mana urutan genom manusia dapat dimanipulasi untuk mencapai efek terapeutik. Termasuk penyembuhan penyakit yang disebabkan mutasi, pengobatan dengan terapi gen, dan penghapusan gen atau urutan genom yang rusak.  Konsep terapi gen adalah menggantikan urutan DNA yang meyebabkan kecacatan dengan urutan DNA yang benar.  Tantangan dari teknoloi gen editing adalah keterbatasan untuk secara tepat mengontrol penyisipan materi genetik ke dalam sel, menjaga stabilitas gen saat pembelahan sel dan kemungkinan efek yang ditimbulkan masih tidak terduga. Selain itu gen yang terlalu besar tidak mudah untuk ditransfer oleh vekor yang tersedia. Namun demikian, kemajuan teknik penambahan gen eksogen telah banyak mengalami kemajuan dan menunjukkan hasil klinis yang menjanjikan sebagai salah satu teknik pengobatan.

MEKANISME GEN EDITING

Dasar untuk bidang gen editing adalah penemuan bahwa kerusakan DNA untai ganda (Double Strand Breaks/DSB) dapat digunakan untuk merangsang perbaikan sel secara endogen.

DNA biasanya diperbaiki melalui salah satu dari dua pathways utama perbaikan homolog (HDR) atau penggabungan akhir (NHEJ). Maria Jasin menunjukkan bahwa efisiensi perbaikan gen melalui rekombinasi homolog dalam sel mamalia bisa dirangsang lebih cepat oleh situs target DSB.   NHEJ berfungsi untuk perbaikan tanpa template melalui religasi langsung dari bagian ujung.  Jalur perbaikan ini rawan kesalahan dan sering menyebabkan penyisipan atau penghapusan (indels) di lokasi istirahat.

Gen Knockout/Mutasi

Bentuk paling sederhana dari gen editing memanfaatkan sifat rawan terjadinya kesalahan dari NHEJ untuk mengenali indels kecil di situs target. NHEJ klasik langsung mengikat DNA diproses akhir sedangkan alternatif NHEJ (Juga dikenal sebagai end microhomology-mediated and joining atau MMEJ). Aktif selama semua tahap siklus sel, kedua jalur NHEJ ini memperbaiki DNA dengan  mutagenesis, menghasilkan pembentukan indels di lokasi istirahat. Ketika situs target nuklease ditempatkan di daerah pengkode gen, indels yang dihasilkan sering menyebabkan frameshifts. Pada penyakit seperti Duchenne Muscular Dhystrophy (DMD), delesi mengakibatkan frameshifts dan kehilangan fungsi protein yang seharusnya dihasilkan, NHEJ diinduksi untuk digunakan untuk mengembalikan reading frame yang benar dari gen.

Penerapan yang paling umum mutagenesis adalah gen knockout (KO). Berbeda dengan tradisi terapi gen, yang terbatas pada penambahan eksogen urut ke dalam genom, penggunaan KO untuk menambahkan gen secara endogen merupakan peluang baru pengobatan terapi gen. Salah satu aplikasinya adalah untuk pengobatan penyakit Huntington. Penyakit ini disebabkan oleh pengulangan alel dari Gen huntingtin (HTT) yang menghasilkan protein HTT mutan yang beracun. Menghilangkan alel mutan dengan editing gen berbasis NHEJ bisa memberikan manfaat klinis untuk pasien Huntington. Metode ini juga diterapkan untuk pengobatan HIV.

Delesi Gen

Daripada langsung menargetkan pada genom manusia, KO gen dilakukan dengan bantuan virus. Metode NHEJ memungkinkan untuk menghapus segmen besar dari DNA. Pendekatan ini berguna untuk strategi terapi yang mungkin memerlukan penghapusan seluruh unsur genomik, seperti daerah penambah, sebagaimana untuk pengobatan hemoglobinopathies dengan penghapusan BCL11A eritroid.

Koreksi Gen

Koreksi gen NHEJ, dapat menginduksi editing gen yang tepat dengan merangsang HDR dengan template donor eksogen yang disediakan. Aktif selama fase S dan G2, HDR secara alami menggunakan kromatit sebagai template untuk perbaikan DNA. Urutan gen eksogen juga dapat digunakan sebagai template untuk proses perbaikan. Perbedaan urutan dalam template donor dapat dimasukkan ke dalam lokus endogen untuk menyembuhkan penyakit yang disebabkan mutasi. Vektor virus seperti lentivirus atau Virus Adeno Associated (AAV) juga dapat digunakan sebagai sumber DNA donor.

Insersi Gen

Meskipun terapi gen tradisional telah berhasil menggunakan vektor virus untuk memasukkan gen eksogen ke dalam genom, ketidakmampuan untuk mengontrol situs integrasi virus ini menimbulkan mutagenesis insersional. Penggunaan template donor, di mana penyisipan genetik yang diinginkan menggunakan urutan homolog identik dengan nuclease, memungkinkan lokasi spesifik penyisipan DNA melalui DSB diinduksi HDR. Target penyisipan gen terapi ke situs yang telah ditentukan dalam genom, mengurangi risiko insersional mutagenesis dan memungkinkan keberhasilan ekspresi gen lebih tinggi. Mekanisme alternatif untuk transgen adalah dengan menggunakan DSBs nuklease untuk membuat DNA kompatibel antara DNA donor dan situs endogen.

Zinc Finger Nucleases (ZFN)

Zinc finger (ZF) adalah protein faktor transkripsi yang jumlahnya melimpah dan Cys2 His2 domain zinc finger adalah salah satu yang paling umum ditemukan dalam genom manusia. Struktur kristal Zif268 sebagai dasar untuk memahami DNA ZFN. Dalam Kehadiran atom seng, domain zinc finger membentuk ββα struktur dengan α-helic masing-masing jari membuat kontak dengan 3 atau 4 bp dalam alur utama DNA.  Peneliti telah berhasil membuat rancangan ZFS bekerja dengan baik. Namun masih banyak yang harus dikembangkan, misalnya menggunakan OPEN untuk menyeleksi protein. Teknologi ZFN memungknkan  domain DNA dan cleavage domain dari FokI restriksi endonuklease bebas satu sama lain. Dengan mengganti FokI DNA binding domain dengan domain zinc finger, dapat  menghasilkan chimeric nucleases dengan pengikatan khusus. Awal percobaan menunjukkan bahwa DSBs diinduksi ZFN dapat digunakan untuk memodifikasi genom baik melalui NHEJ atau HDR .Teknologi l\telah berkembang digunakan untuk memodifikasi gen somatik manusia

TALENs

Penemuan TALE dari gen Xanthomonas sangat menarik untuk mendesain DNA binding protein. Asam amino TALE 33-35 mengulang setiap mengikat pasangan basa tunggal DNA dengan spesifisitas ditentukan oleh dua residu hypervariable. Struktur kristal DNA mengungkapkan bahwa setiap pengulangan membentuk struktur helix dihubungkan oleh sebuah loop yang menyajikan residu hypervariable ke dalam alur utama sebagai protein pembungkus di sekitar DNA dalam struktur superheliks. Juga mirip dengan ZFNs, Talens telah terbukti secara efisien menginduksi baik NHEJ dan HDR di somatik manusia.

Meganucleases

Teknologi meganuclease melibatkan spesifisitas pengikatan DNA endonucleases. Kelas terbesar dari endonuklease adalah keluarga LAGLIDADG, yang meliputi I-CreI Saya dan I-SceI.  Melalui kombinasi desain dan seleksi, endonuclease dapat direkayasa untuk menciptakan urutan baru. Banyak penelitian yang menunjukkan bahwa meganuklease dapat digunakan untuk mengedit genom DNA.

CRISPR / nucleases

CRISPR-Cas berasal dari sistem kekebalan tubuh yang berkembang pada bakteri untuk melawan invasi plasmid dan virus. Tiga komponen diperlukan untuk sistem CRISPR nuklease adalah Cas9 protein, crRNA dan tracrRN. Sistem ini dapat dikurangi menjadi dua komponen fusi dari crRNA dan tracrRNA menjadi panduan tunggal RNA (gRNA). Pembentukan heterodupleks DNA-RNA di situs target memungkinkan untuk pembelahan DNA target dengan Cas9-RNA kompleks. Berbeda dengan tiga sistem nuklease, CRISPR/Cas nucleases tidak memerlukan rekayasa protein baru untuk setiap situs target DNA. Lebih mudah dilakukan hanya dengan mengubah daerah pendek dari gRNA yang menentukan spesifisitas. Selain itu, karena protein Cas9 tidak secara langsung digabungkan ke gRNA, sistem dapat digunakan bersamaan dengan gRNAs untuk menginduksi DSBs di beberapa lokus.

APLIKASI GENE TERAPI

Kemampuan untuk memanipulasi setiap urutan genom dengan mengedit gen telah menciptakan beragam kesempatan untuk mengobati banyak penyakit berbeda

Antivirus

Aplikasi yang paling sederhana dari editing gen adalah dengan menggunakan mekanisme NHEJ untuk Knockout (KO) gen dalam terapi sel secara ex vivo, di mana sel-sel somatik dapat diisolasi, dimodifikasi, dan transfer kembali ke pasien. Mekanisme yang paling canggih adalah modifikasi sel T secara ex vivo untuk melumpuhkan CCR5 coreceptor digunakan untuk HIV. Studi awal ini menunjukkan penurunan viral load dan peningkatan jumlah CD4+ T-sel pada tikus yang terinfeksi HIV di mana gen CCR5 telah digantikan oleh nucleases zinc finger. Hasil yang sama pada editing gen dan transplantasi CD34+ HSCS ke tikus yang telah di iradiasi, memungkinkan untuk melindungi keturunan dari infeksi HIV CCR5-tropik. Telah dilakukan serangkaian uji klinis uji positif HIV pada pasien manusia. Sejauh ini hasil penelitian menunjukkan metode gen editing dapat dilakukan bagi pasien manusia.

Data dari penelitian ini menunjukkan efikasi klinis yang lebih besar pada pasien yang heterozigot. Pengendalian virus HIV dilakukan dengan pengembangan strategi menggunakan gen editing mirip dengan KO CCR5  dengan Talens, CRISPR/Cas9 dan meganucleases. Penelitian lain telah berkembang dengan menargetkan CCR5 untuk meningkatkan daya tahan terhadap infeksi HIV. Termasuk sasaran dari coreseptor CXCR4 232 atau PSIP1 yang mengkode LEDGF/protein p75 yang dibutuhkan untuk integrasi HIV. Selain virus HIV juga telah diterapkan untuk berbagai virus lainnya  termasuk virus hepatitis B, virus herpes, dan virus papiloma manusia.  Strategi ini biasanya melibatkan menghapus genom virus dengan degradasi berikut.

Cancer Immunotherapy

Cancer immunotherapy telah diakui sebagai salah satu kemajuan terbesar dalam penelitian biomedis dalam beberapa tahun terakhir. Secara khusus, mengadopsi imunoterapi T-sel, di mana sel T direkayasa untuk menyerang antigen kanker secara ex vivo dan ditransfer kembali ke pasien, telah mampu mengobati beberapa kasus limfoma, leukemia, dan melanoma. Meskipun keberhasilan dan uji klinis yang menjanjikan sedang berlangsung, ada beberapa daerah di mana imunoterapi T-sel bisa ditingkatkan dengan gen editing. Strategi untuk imunoterapi melibatkan rekayasa sel T untuk mengekspresikan reseptor sintetis yang dikenal sebagai reseptor antigen chimeric atau CAR pada sel kanker. Tantangan utama untuk pengembangan immunoterapi sel T dapat adalah kebutuhan untuk menggunakan sel autologous untuk menghindari penolakan kekebalan tubuh. Untuk mengatasi hal ini, gen editing menggunakan untuk KO pada antigen leukosit manusia (HLA) oleh sistem kekebalan tubuh.

Pendekatan ini mungkin berguna untuk allogeneic terapi sel luar imunoterapi T-sel. Sebagai contoh, pendekatan yang telah diterapkan dalam sel pluripoten manusia memiliki kegunaan yang beragam dalam pengobatan regeneratif serta di sel endotel yang dapat digunakan untuk cangkok pembuluh darah alogenik. Hambatan utama untuk imunoterapi sel T adalah penghambatan fungsi efektor sel T oleh ekspresi inhibitor pos pemeriksaan di permukaan sel-sel tumor.

Sebagai contoh, pengikatan inhibitor PD-1 reseptor pada sel T untuk memblokir fungsi efektor sel T dan menginduksi apoptosis. PD-1 reseptor terhambat sehingga sel-sel kanker berhasil menghindari sistem kekebalan tubuh. Sebagai strategi untuk mengatasi hal ini, editing gen telah digunakan untuk KO
PD-1 dalam sel T, mengarah ke peningkatan fungsi efektor sel T.

Gangguan Hematologi

Uji klinis terapi gen pertama Therapiutik Adenosin Deaminase (ADA) transgen sel-sel T untuk mengobati anak-anak dengan immunodefisiensi (ADA-SCID) dan kemudian pengobatan SCID X-linked (X-SCID) oleh pengiriman gen retroviral untuk CD34+ hematopoietik sel induk (HSCS). Fokus awal terapi gen ex vivo untuk immunodeficiency didasarkan pada kebutuhan untuk mengembangkan pengobatan serta memanfaatkan metode untuk pengiriman gen retroviral. Contoh pertama dari koreksi gen endogen dalam sel manusia difokuskan pada reseptor IL2 rantai gamma yang bermutasi di X-SCID. Koreksi di CD34 + HSCS sebagai alat gen editing juga telah dikembangkan untuk memperbaiki mutasi gen yang terkait dengan ADA-SCID  dan SCID radiosensitive, disebabkan oleh gangguan DNA-dependent kinase protein (DNA-PK).

Pembentukan editing gen di CD34+ HSCS dan sel pluripotent manusia telah memberikan pilihan baru untuk mengobati gangguan hematologi, termasuk penyakit sel sabit, yang disebabkan oleh mutasi titik E6V tertentu di β-globin, dan β thalassemia, yang disebabkan oleh jenis mutasi ke β-globin. Mutasi globin diperbaiki dengan mengedit gen kedua di iPSCs manusia. Gen editing untuk terapi sel eritroid dan inaktivasi enhancer dengan mengedit gen menyebabkan penekanan BCL11A dan peningkatan regulasi γ-globin hanya dalam sel erythroid. Pendekatan ini dapat digunakan sebagai mekanisme terapi untuk penyakit sel sabit dan thalassemia.

Editing Gen Hati

Target koreksi gen dalam hati memiliki potensi untuk mengobati berbagai penyakit, termasuk gangguan pembekuan hemofilia A dan hemofilia B, termasuk penyakit Fabry, penyakit Gaucher, Pompe, von Gierke, Hurler dan Hunter sindrom. Namun, masing-masing populasi pasien relatif kecil dan jenis mutasi untuk setiap gen yang terlibat dalam penyakit ini berbeda. Permasalahan yang masih muncul apakah koreksi gen dapat dicapai untuk mencapai keberhasilan terapi jika didorong oleh promotor endogen alami yang sesuai untuk setiap gen. Pendekatan untuk mengatasi masalah ini adalah integrasi gen terapeutik ke albumin lokus hilir promotor albumin endogen. Pendekatan ini telah efektif digunakan pada tikus berbasis AAV donor homolog template untuk mengobati hemofilia tanpa nucleases 71 dan dengan ZFNs yang mungkin untuk meningkatkan penargetan efisiensi.

Munculnya CRISPR sistem/Cas9 memungkinkan teknoologi gen editing untuk menyembuhkan berbagai macam penyakit. Editing gen dengan CRISPR/Cas9 menggunakan tikus dengan injeksi melalui vena plasmid DNA ke tikus. Meskipun secara keseluruhan efisiensi gen editing yang relatif rendah (0,4%), model ini memungkinkan untuk pemilihan koreksi sel.

PCSK9 mengkode proteinase. Penurunan tingkat LDLR menyebabkan metabolisme yang lebih rendah pada kolesterol LDL (LDL-C), peningkatan LDL-C, dan peningkatan risiko penyakit kardiovaskular. Penemuan variasi genetik alami yang mengarah ke aktivitas tinggi atau rendah dan kadar kolesterol yang sesuai telah menyebabkan ketertarikan pada PCSK9 blocking untuk menurunkan kolesterol. Dua studi yang berbeda telah menunjukkan bahwa pengobatan tunggal dari Cas9 dan PCSK9 bertarget gRNA diberikan ke hati dapat kadar kolesterol.

Selain editing gen dalam hati, juga digunakan untuk diferensiasi sel-sel pluripotent manusia menjadi fungsi hepatosit untuk sebagai alternatif koreksi sel. Sebagai contoh, α-1-Antitrypsin dikoreksi oleh editing gen di iPSCs manusia dan kemudian dibedakan menjadi sel-sel hati yang menunjukkan pemulihan gen. Meskipun jenis produk berbasis sel mungkin secara signifikan lebih kompleks daripada obat berbasis virus, penelitian ini memungkinkan untuk analisi genom yang komprehensif.

Gangguan Neurotransmitter

Kemajuan dalam pengiriman gen dan transplantasi sel ke pusat sistem saraf, otot rangka dan jantung memungkinkan terapi sel digunakan pada banyak gangguan neuromuscular, termasuk DMD, atrofi otot, ataksia, Huntington, dan amyotrophic lateral sclerosis (ALS).  DMD disebabkan oleh mutasi pada gen distrofin, yang paling sering adalah delesi yang menggeser fragmen gen keluar dari frame dan membuat produk protein nonfungsional. Karena coding urutan gen distrofin sangat besar (14 kb), tidak dapat dikemas menjadi vektor pengiriman virus. Meskipun pemotongan mini gene telah dikembangkan untuk menjadi vektor virus, hanya sebagian yang fungsional dibandingkan dengan itu gen yang utuh dan kemampuan mereka untuk membalikkan penyakit manusia masih harus diteliti lagi. Teknologi genom editing dalam sel kultur dari pasien DMD menunjukkan disfungsi trophin atau restorasi ekspresi protein distrofin.

Untuk mengembangkan menjadi suatu pendekatan yang berpotensi diterapkan secara klinis untuk pasien DMD, penelitian terbaru telah memasukkan yang CRISPR sistem/Cas9 ke vektor AAV dengan tropisme untuk otot jantung.   Telah diuji pada tikus dengan diiterapkan secara lokal melalui intramuscular atau sistemik melalui injeksi intravena untuk  DMD, editing gen oleh CRISPR / Cas9. Satu studi menunjukkan editing gen Pax7-positif sel progenitor otot yang dapat bertindak sebagai sumber terbarukan sel di mana gen distrofin telah diperbaiki. Pendekatan translasi ini dilakukan editing gen di otot rangka dengan adenoviral dan koreksi mutasi distrofin di single-cell embrio tikus  untuk membalikkan gejala penyakit.

Gangguan Kulit

Pengembangan cangkok kulit dari autologus dan sel alogenik, termasuk sel-sel iPS, menciptakan kemungkinan baru untuk mengobati penyakit genetik yang mempengaruhi kulit. Sebagai contoh, resesif distrofik epidermolisis bulosa adalah penyakit yang disebabkan oleh mutasi pada gen pengkodean jenis kolagen VII. Kemungkinan dapat diobati dengan memperbaiki sel-sel pasien dengan genom editing dan menggunakan sel-sel untuk cangkok kulit. Dalam satu penelitian, mutasi pada gen kolagen tipe VII yang dikoreksi dalam fibroblas pasien kemudian  diprogram untuk sel iPS yang dapat digunakan untuk membentuk struktur kulit secara in vivo. Studi lain juga mengoreksi mutasi penyebab penyakit dalam sel iPS pasien, dan menggunakan sel-sel ini untuk menghasilkan epitel keratinosit.

Gangguan Mata

Telah dilakukan uji klinis untuk pengobatan Leber Congenital Amaurosis tipe 2 (LCA2) dan telah mendorong penelitian retina menggunakan bidang terapi gen. Menggunakan injeksi subretinal dari AAV encoding gen RPE65. LCA adalah penyebab utama dari kebutaan dan disebabkan oleh mutasi pada setidaknya 18 gen berbeda. LCA10, bentuk paling umum dari LCA, disebabkan oleh mutasi pada sekitar 7,5 KB CEP290 gen dan karena itu pendekatan dengan terapi gen standar digunakan untuk LCA2 tidak disetujui karena ukuran besar. S. Aureus Cas9 digunakan untuk menghapus sebuah daerah intronic di CEP290 gen yang mengandung mutasi dan menciptakan situs yang mengganggu urutan gen coding. Penghapusan daerah intronic ini dipulihkan ekspresi CEP290 yang tepat.

Gangguan Pernafasan

Cystic fibrosis disebabkan oleh mutasi CFTR channel. Hilangnya fungsi ini menyebabkan disfungsi transportasi cairan epitel di beberapa organ. Khususnya, hilangnya cairan transportasi cairan lender dalam paru-paru dan terjadinya infeksi sehingga menyebabkan infeksi saluran napas. Editing gen telah digunakan untuk memperbaiki mutasi CFTR di sel induk usus pasien dan sel-sel iPS yang bisa dibedakan menjadi sel-sel epitel. Tantangan bagi terapi gen dan gen editing untuk cystic fibrosis adalah pengiriman gen yang efisien untuk epitel paru-paru.

Antimikroba

Disamping mengubah genom manusia penelitian mengenai gen editing juga dikembangkan untuk menyerang bakteri pathogen. Studi terbaru menunjukkan bukti pendekatan menggunakan CRISPR/Cas9 untuk menghilangkan bakteri dalam tikus dan infeksi larva ngengat, serta selektif menghilangkan plasmid dan populasi bakteri. Strategi alternatif ini untuk mengubah sistem CRISPR dengan pengiriman crRNAs, seperti yang baru-baru ini dilakukan untuk menghapus selektif strain bakteri dengan sistem CRISPR tipe I. Pilihan sistem tipe I adalah penting mengingat bahwa enzim CAS3 tipe I sistem memiliki aktivitas exonuclease yang dapat memfasilitasi DNA. tipe II CRISPR/Cas9 hanya memotong DNA.

KESIMPULAN DAN ARAH MASA DEPAN

Kemajuan luar biasa telah dibuat dalam mengatasi tantangan terapi gen konvensional dengan mengembangkan teknologi baru untuk dari genom manusia. Hal ini telah membantu mengatasi beberapa kendala yang telah melanda bidang gen terapi selama beberapa dekade. Hal yang masih menjadi kendala adalah mengenai keselamatan dan pengiriman. Dalam hal ini, kemajuan pesat sedang dibuat baik untuk meningkatkan spesifisitas alat genom editing dan meningkatkan sensitivitas untuk menilai kekhususan genome yang luas.

Banyak keberhasilan praklinis yang Studi terakhir di sini, serta perkembangan genom editing dalam uji klinis, merupakan sumber optimisme yang signifikan untuk masa depan bidang ini. Kemajuan pesat di lapangan kemungkinan akan terus berlanjut menghasilkan teknologi baru yang akan memperluas lingkup genom editing. Alternatif gen editing, tidak bergantung pada DSB, sistem CRISPR adalah alternatif. Kesimpulan, editing genom telah mengubah definisi gen dan terapi sel dan telah menjadi faktor kunci dalam bidang ini, tetapi membutuhkan banyak penelitian untuk dapat diterapkan pada manusia.